WGCNA分析

1.WGCNA基本概念：

WGCNA（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA），中文称为加权基因共表达网络分析，是构建基因共表达网络的常用方法。基因共表达网络：定义每个节点为一个基因，在不同样本中存在表达共性的基因处于同一个基因网络，而基因之间的共表达关系一般由它们之间的表达相关系数衡量。

WGCNA算法首先假定基因网络服从无尺度分布，并定义基因共表达相关矩阵、基因网络形成的邻接函数，然后计算不同节点的相异系数，并据此构建分层聚类树（hierarchical clustering tree），该聚类树的不同分支代表不同的基因模块（module），模块内基因共表达程度高，而分属不同模块的基因共表达程度低。最后，探索模块与特定表型或疾病的关联关系，最终达到鉴定基因网络的目的。

WGCNA分析方法旨在寻找协同表达的基因模块（module），并探索基因网络与关注的表型之间的关联关系，以及网络中的核心基因。

WGCNA分析适用于复杂的数据模式，推荐5组（或者15个样品）以上的数据。一般可应用的研究方向有：不同器官或组织类型发育调控、同一组织不同发育调控、非生物胁迫不同时间点应答、病原菌侵染后不同时间点应答。

2.WGCNA分析原理：

从方法上来讲，WGCNA分为表达量聚类分析和表型关联两部分，主要包括基因共表达网络构建、模块鉴定、模块信息提取、模块与性状关联、模块内基因的调控关系等步骤。

Step 1：基因共表达网络构建：计算任意两个基因之间的相关系数（Person Coefficient）。为了衡量两个基因是否具有相似表达模式，一般需要设置阈值来筛选，高于阈值的则认为是相似的。但是这样如果将阈值设为0.8，那么很难说明0.8和0.79两个是有显著差别的。因此，WGCNA分析时采用相关系数加权值，即对基因相关系数取N次幂，使得网络中的基因之间的连接服从无尺度网络分布(scale-freenetworks)，这种算法更具生物学意义。

Step 2：模块鉴定：通过基因之间的相关系数构建分层聚类树，聚类树的不同分支代表不同的基因模块，不同颜色代表不同的模块。基于基因的加权相关系数，将基因按照表达模式进行分类，将模式相似的基因归为一个模块。这样就可以将几万个基因通过基因表达模式被分成了几十个模块，是一个提取归纳信息的过程。

Step 3：模块信息提取：分析模块的基因热图及关键基因，通过挑选模块内相关性系数前30的基因，根据表达情况做热图和表达柱形图，展示模块的特征。

Step 4：模块与性状关联：通过输入性状文件或者默认单个样品将模块与性状进行关联，研究模块与性状的相关性，挑选最最感兴趣的性状的模块进行分析。

Step 5：模块内基因的调控关系：通过Cytoscape或者其他的基因调控网络展示软件，展示模块内的基因相关关系。

下图为WGCNA分析流程示意图：

3.WGCNA基本术语：

l 权重（weghted）：基因之间不仅仅是相关与否，还记录着它们的相关性数值，数值就是基因之间的联系的权重（相关性）。权重为基因与所有其他基因相关系数之和；非权重，设定一个阈值，大于阈值则为连通，否则没有联系，只有0和1的关系。比如我们设定阈值为0.8，我们就很难说明0.79与0.8具有显著性差异。

下图权重与非权重示意图：

l 模块（module）：表达模式相似的基因分为一类，这样的一类基因成为模块。

l hub module（关键模块）：指与表型数据高度相关或与研究密切相关的模块。

l Eigengene（模块特征基因）：被定义为给定模块的第一个主成分，是该模块最具代表性的表达模式，可理解为近似代表一个模块所有基因的表达状态的指标，但并非真实存在的基因。

l Connectivity/degree（连接度）：指某个基因与该网络中其他基因连接强度的总和。

l Module membership（MM，模块归属）:也称基于特征基因的连接（kME，eigengene-based connectivity），即某个基因的表达模式与模块特征基因之间的相关性；该值越大，表示该基因归属该模块的可能越大。

l Gene signicance（GS，基因显著性参数）：即基因重要性度量，基因表达模式与某样本特质之间的相关，一般相关值越大，表示该基因越重要，可以是p-value的log转换值，可以是基因与某个通路相关性指标，也可以是基因与某个表型特征的相关性。

l Adjacency Matrix（邻近矩阵）：是图的一种存储形式，用一个一维数组存放图中所有顶点数据；用一个二维数组存放顶点间关系（边或弧）的数据，这个二维数组称为邻接矩阵。

l TOM（Topological overlap matrix）：把邻接矩阵转换为拓扑重叠矩阵，以降低噪音和假相关，获得的新距离矩阵，这个信息可拿来构建网络或绘制TOM图。

4.主要参数：

①任务名称：对本次小工具运行任务进行命名，方便后续任务查找及分析结果查看。

②表达量矩阵表：第一列为基因id，表头必须为seq_id/gene_id，后面为基因在不同样品的表达量，趋势顺序按样品在表格中的顺序排列。输入的表格文件，必须为txt格式，可以选择在excel中将数据打开，然后另存为"文本文件（制表符分隔）（*.txt）"。注：上传的文件中第一列的基因id以及样本名称不允许存在特殊字符，只能是字母数字和下划线，请注意核查上传文件格式，避免报错。

示例文件：gene_express.txt

③目标基因列表：该参数为选填项，如果不上传该文件，则按照表达量矩阵表的所有基因进行分析。该文件内容为一列Gene_id，无表头信息，文件为txt格式。

示例文件：gene_list.txt

④表型数据表：表型数据文件，该文件必须包含列名，第一列为样本名，其他列为表型数据，txt文件，制表符分隔。支持两种数据类型，非连续性（discrete）和连续性（continuous），非连续数据示例见trait_1，连续性示例见trait_2。

注：样本总数要≥15

示例文件：trait_1.txt

备注：仅有样本和样本所属组别信息，第一列为样本名称，第二列为组别名称，“表型数据类型”选择“非连续”。

示例文件：trait_2.txt

备注：样本具有相应的具体表型统计，第一列为样本名称，其他列为表型数据（比如weight，height等），也可包含非连续性数据（比如男、女；复发、不复发）需要转换成0，1，参考该示例填写即可，“表型数据类型”选择“连续”。

注意：无论连续性数据还是非连续性数据，列表名称不能包含特殊字符（例如空格、%、&、$等，且要保证样本数量和名称与表达量矩阵中的样本一致）。

⑤表型数据类型：区分连续和非连续两种类型，需要注意的是上传的表型数据表和选择的数据类型要保持一致，避免运行报错！

注意：其他高级参数解释可参照页面问号。

5.结果解读：

模块成员统计图：

注：横坐标为不同的模块（以模块颜色表示），纵坐标为属于各模块的成员数目（基因/转录本）。

模块相关性热图：

注：展示模块与模块间的相关性大小，图中每列或行代表一个模块（以模块颜色表示），图中的颜色表示模块间的相关性大小，默认指定红色代表模块间的相关性较大，蓝色代表模块间的相关性较小，具体请见右上方的图例。左侧或上方为模块聚类的树状图，两个模块分支离的越近，说明这两模块相关性越大。

模块与表型相关性热图：

注：展示模块与具体表型的相关性情况，左侧第一列代表不同模块，用不同的颜色表示，其余各列代表不同表型/样本/分组。图中左侧第一列中的数字表示该模块的基因/转录本数目，其余各列数据表示模块与表型的相关性系数及显著性P值（括号内）。默认指定红色代表模块与表型的相关性较大，蓝色代表模块与表型的相关性较小，具体请见右上方的图例。通常筛选相关性最高且P值越显著的模块作为该表型的特征模块。

6.参考文献：

[1] Zhang B , Horvath S . A general framework for weighted gene co-expression network analysis.[J]. Statistical Applications in Genetics & Molecular Biology, 2005, 4(1):Article17.

[2] Langfelder P , Luo R , Oldham M C , et al. Is My Network Module Preserved and Reproducible?[J]. Plos Computational Biology, 2011, 7(1):87-93.

[3] Conesa A , Gotz S , Garcia-Gomez J M , et al. Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research[J]. Bioinformatics, 2005, 21(18):3674-3676.

[4] Peter, LangfelderSteve, Horvath. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis[J]. Bmc Bioinformatics, 2008.

7.FAQ：

问题1：样品数量是否有要求？

解答：建议对至少15个样本的数据集尝试WGCNA。高通量环境中，少于15个样本的相关性对于基因共表达网络存在较大的背景噪声，导致在生物学上没有意义。如果可能的话，至少应有20个样本；样本越多结果越可靠越精确。

问题2：是否需要对基因进行筛选？

解答：基因可以通过均值或方差进行过滤，因为低表达或无差异表达的基因通常代表噪声。用均值还是方差过滤哪一种方法更好尚有争议。两者都有优点和缺点，由于均值和方差通常是相关的，因此如需过滤建议滤掉表达量低，在样本间表达差异不大的基因。但是不建议使用差异基因进行分析，因为WGCNA是一种基于基因表达谱对基因进行聚类的无监督分析方法。差异基因本质将形成单个（或几个高度相关）的模块，从而无法获得软阀值，导致无尺度网络假设无效。

问题3：可以使用WGCNA分析RNA-Seq数据吗？

解答：可以。就WGCNA而言，处理归一化的RNA-seq数据与归一化的芯片数据本质上没有任何区别。建议在进行WGCNA分析前对表达矩阵进行转换，推荐使用Deseq2的varianceStabilizingTransformation或log2(x+1)对标准化后的数据做个转换。如果数据来自不同的批次，需要先移除批次效应。如果数据存在系统偏移，需要做quantile normalization后再进行分析。