limma差异分析

工具概述

差异分析就是计算两组样本之间差异表达的基因。通常我们定义基因/转录本表达量差异倍数＞2、并且P值（或Q值）小于0.05为显著差异表达的基因/转录本，具有统计学意义。这个阈值可以自己调整。该差异分析是利用limma对两组样本间的基因/转录本差异显著性进行分析的，该软件支持配对差异分析。

操作方法

基础参数设置：

1.设置任务名，便于您查询后续的文件结果。

2.选择基因数据表：文件必须为txt格式。可以选择在excel中将数据打开，然后另存为"文本文件(制表符分隔)(*.txt)"。输入的文件第一行为样本ID，第一列为基因ID，表中的数值为每个样本的基因count数（即reads数目）。

3.选择分组文件：定义分组信息。文件必须为txt格式。第一列为样本名，第二例为所在的组名。注意：即使没有实验重复，依然需要填写这个文件（1个样本为1组）。

4.选择组间比较文件：列出要进行差异分析的比较组的文件。文件必须为txt格式。有两列，在进行差异分析时是第二列比上第一列。如第一列是A（组），第二列是B（组），则为B组比上A组。一行为一个比较组。

5.选择显著性水平：判定样本间基因/转录本表达是否显著差异的筛选阈值，默认p-adjust＜0.05。若差异基因/转录本过少，可使用p-value进行筛选，或者调高阈值，如0.1；若差异基因/转录本过多，可调低阈值，如0.01；若不以该条件筛选，请填写“1”。p-adjust/p-value填写范围[0,1]。

6.选择多重校正方法：为了控制整体推断结果发生错误的概率或频次， 对统计检验获得的pvalue进行矫正，即进行多重检验矫正。小工具提供了BY、BH、Holm、Bonferroni四种，其中Bonferroni最为严格，其次是Holm，再次之是BY和BH，BY和BH严格性相当，默认选择BH。

7.填写差异倍数：默认为2，表示样本间基因/转录本表达上调2倍和下调2倍以上（即FC≥2和FC≤2），可根据差异基因/转录本数目，适当调整该值；若不以该条件筛选，请填写“1”；该值范围≥1。

高级参数设置：

8.选择样本配对文件：文件必须是txt格式。文件填写样本名称，对列数没有限制，每一行为具有配对关系的样本。若上传，则按照上传的样本配对关系进行配对差异分析。

9.选择标准化方法：提供四种标准化方法（TMM、TMMwzp、RLE、uqua），默认TMM。

10选择是否对数据进行voom转换，默认True

11.运行后可在结果页面，使用图表插件对图标题内容，字体，字号，配色等进行调整。

结果解读

火山图

注：横坐标为基因/转录本在两个样本间的表达差异倍数，即处理样的表达量除以对照样的表达量得到的数值，纵坐标为基因表达量变化差异的统计学检验值即p值。-log10（p值）越大则表达差异越显著，横纵坐标的数值都做了对数化处理。图中每个点代表一个特定的基因，红色点表示显著上调的基因，蓝色点表示显著下调的基因，灰色点为非显著差异基因。将所有基因映射上去之后，可以获知，在左边的点为表达差异下调的基因，右边的点为表达差异上调的基因，越靠近两边和上边的点表达差异越显著。

柱形图

注：横坐标为两两组比较标签，纵坐标为基因/转录本上调/下调的数量；up代表上调的基因/转录本；down代表下调的基因/转录本。

参考文献

Noble W S. How does multiple testing correction work?[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(12): 1135-1137.