单基因GSEA分析

1、工具概述

本工具是基于单一特征的（蛋白/基因等）的基因集富集分析。以单一特征的表达量作为表型，确定先验基因集与表型之间是否存在统计学上的差异。预先定义的基因集S（基于先验知识的基因注释信息）和待测基因集L（一般是表达矩阵）；然后GSEA目的就是为了判断S基因集中的基因是随机分布于L（排序后的数据集），还是聚集分布在L的顶部或者底部（这也就是富集）。如果待测基因集中的某些基因显著富集在L的顶部或者底部，这说明这些基因的表达（因为其是根据表达谱数据）对定义的表型的差异有显著影响，从而找到我们关注的基因。

2、操作方法

①任务名，输入任务名称，便于您后续查询对应结果。

②表达量数据表：表达量数据表格式要求为制表符（Tab）分隔的txt文件。第一列id：可以为蛋白、转录、代谢物等的ID号或英文名称，不支持中文、拉丁文、/、（）等特殊符号。第二列到第N列为样本的表达量数据。

③基因ID：必须为表达量数据表中第一列中出现的ID号或名称，基因ID仅可填写一个。

④排序算法：Pearson，Pearson相关系数，又称积差相关系数，是表达两变量线性相关程度及方向的统计指标。

⑤先验基因集：

（1）MSigDB（Version6.2, http://software.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp），全称Molecular Signatures Database分子标记数据库，目前仅收录了人，小鼠和大鼠三个物种，且绝大部分为人。比如，对于人的基因，从位置，功能，代谢途径，靶标结合等多种角度出发，构建出了许多的基因集合，一个基因集合中包含了具有相近位置或类似功能的许多基因，Broad Institute研究所将它们构建的基因集合保存在MSigDB数据库中。并将所有的基因集划分为8大类别，具体如下：

您可选择关注的一、二、三级先验基因集进行GSEA分析。

（2）自定义先验基因集

要求文件后缀为gmx 或 gmt，第一列为基因集名称，第二列为基因集描述，第三列到第N列为基因集中包含的基因，每列一个。列与列之间用制表符（Tab）分隔。

⑥先验基因集大小的范围设置：默认，15-500，您可根据需要进行调整，最大可到1000。在进行GSEA分析时，软件会考虑基因集的大小，对基因集的ES值进行标准化，使得不同基因集之间可通过NES进行比较，但这种标准化方法对于极大或极小的基因集的计算不是特别准确，因此建议您使用默认值。

⑦选择 |NES| 前N的基因集进行展示：

NES是用于检验蛋白集富集分析结果的重要统计值。在对富集得分进行标准化的过程中，GSEA考虑了蛋白集的大小和蛋白集与表达谱之间的相关性。因此，NES可用于比较表达谱数据集在不同功能蛋白集中的富集程度（一般随机组合次数为1,000），NES=某一功能蛋白集的ES/数据集所有随机组合得到的ES平均值。公式如下：

3、结果解读

上方曲线表示累计ES值的变化趋势，最高点即为基因集的的ES值； 中间竖线表示先验基因集在排序后的基因列表中的位置，用黑色线条标记了先验基因集中每个基因出现在排序列表中的位置； 下方热图+灰色面积图表示排序基因列表中基因的分布，A）热图：红色部分对应的基因与表型的正相关关系，蓝色部分对应的蛋白对应的基因与表型的负相关关系；B）面积图代表的是随着排序列表的顺序，排序度量（Ranking Metric）值的变化。排序度量值用于表征基因与表型的相关性。随着在排序后的基因列表上的移动，排序度量值从正相关向负相关逐渐变化。对于时间序列或者是关注的单基因这样的连续型表型，正值表示基因与表型数据之间的正相关关系，而负值表示相反的关系。

4、参考文献

Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, Paulovich A, Pomeroy SL, Golub TR, Lander ES, Mesirov JP. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Oct 25;102(43):15545-50. doi: 10.1073/pnas.0506580102. Epub 2005 Sep 30. PMID: 16199517; PMCID: PMC1239896