转录因子分析（SCENIC）

1.工具概述：

SCENIC （single-cell regulatory network inference and clustering）是一个基于共表达和motif分析，计算单细胞转录组数据基因调控网络重建以及细胞状态鉴定的方法，可以利用其分析细胞或亚群的转录因子调控。

2.操作方法：

①任务名称：对本次小工具运行任务进行命名，方便后续任务查找及分析结果查看。

②Seurat RDS文件：此文件格式为RDS，RDS是R语言中利用二进制保存的源文件。此处需要上传的是单细胞数据中Seurat软件的RDS文件。此文件主要包括表达量矩阵文件、降维聚类之后每个细胞对应的cluster和样本（sample）结果。以上信息为必须，除此之外也可以加上每个细胞对应的组别（group）和细胞类型（celltype）信息。

示例文件：

③细胞类型注释文件：此结果为选填项。此表共计两列，第一列为cluster，第二列为celltype；只能以英文字符开头，允许字母、数字、下划线，不能出现“+”“-”等特殊符号，此表格为文本文件(制表符分隔)(*.txt)文件。

示例文件：

④分析逻辑：选择细胞通讯的分析逻辑。此处“按单个样本分析”的逻辑为：每个样本单独去分析该样本内的转录因子；“按组别分析”的逻辑为：每个组别单独分析该组别内的转录因子。

⑤样本筛选：输入待分析的样本名称，允许多个同时检索，中间以英文状态逗号隔开。

⑥分组信息表：分组方案，第一列为样本名，第二列为组名，制表符分隔。表头固定，必须以#开头。

示例文件：

⑦物种选择：选择需要分析的物种信息。默认仅能分析人、小鼠和果蝇。其他物种需要与人的基因做同源比对。

3.结果解读：

SCENIC（single-cell regulatory network inference and clustering）是一个基于共表达和motif分析，计算单细胞转录组数据基因调控网络重建以及细胞状态鉴定的方法，可以利用其分析细胞或亚群的转录因子调控。

SCENIC软件的使用首先要输入单细胞基因表达量矩阵，之后会有三个步骤完成转录因子分析：第一步是构建共表达网络；第二步是构建TF-targets网络；第三步是计算Regulons活性，每一个步骤都由一个专门的软件包完成。其中，所谓Regulons，也就是调控子，为SCENIC中的关键概念，其意义为：是受同一个调控元件（转录因子）调控的一群基因的集合。每个调控子可以定义为一个转录因子及其靶基因的集合。

具体分析流程见下：

3.1 Motif富集结果

根据转录因子与靶基因共表达模块，可以计算出显著富集的motif注释信息。motif富集结果表（MotifEnrichment.csv）如下表所示：

表注：（1）motifDB：数据库名称；（2）geneSet：基因集名称；（3）motif：motif的ID；（4）NES：基因集中基序的标准化富集分数；（5）AUC：曲线下面积（用于计算NES）；（6）TFinDB：指示突出显示的TF是包含在高置信度注释（两个星号）还是低置信度注释（一个星号）中；（7）TF_highConf：根据“ motifAnnot_highConfCat”注释的转录因子；（8）TF_lowConf：根据“ motifAnnot_lowConfCat”注释的转录因子；richedGenes：在给定基序上排名较高的基因；（9）nErnGenes：高度排名的基因数量；（10）rankAtMax：在最大富集时的排名，用于确定富集的基因数；（11）enrichedGenes：在给定motif上排名较高的基因。

3.2 Regulon活性结果

对于一个给定的Regulon，通过比较所有细胞间的AUCell（area under the recovery curve）打分值，我们可以识别哪些细胞具有更显著高的regulon活性。

输入为一个基因集，输出为基因集每个细胞的‘activity’。这些基因集即regulon，包含TFs和他们假定的target。基于recovery analysis将根据表达水平将所有基因进行排序。转录因子对应的调控基因结果表见下：转录因子基因调控结果表（regulonTargetsInfo.tsv）

表注：TF：转录因子名称；gene：TF靶基因名称；nMotif：靶基因在数据库的motif数量；bestMotif：最显著富集的motif名称；NES：标准富集分数，分值越高越显著；motifDB:数据库；coexModule：转录因子-基因（Co-expression module）共表达网络结果；spearCor：TF与靶基因的相关性。

AUC代表了与细胞内其他基因相比，特征基因中表达基因的比例及其相对表达值。AUCell使用AUC来计算输入基因集的关键子集是否在每个细胞的排名Top都得到了富集。软件会将每个细胞转为AUC值，对每个细胞的AUC score值进行可视化，随机提取500个细胞可视化结果见下：Regulon活性热图（RegulonActivity_heatmap）

图注：行为Regulon，列为细胞，颜色为AUC score值，颜色由蓝到红表示调控子的活性由低到高。Bar分别代表样本、cluster以及celltype。

软件也会基于每个细胞的AUC值，计算每个亚群/细胞类型中细胞的平均活化值，再对每个转录因子的亚群/细胞类型平均活化值进行Z-score归一化，得到每个cluster/celltype的Z-score矩阵。

根据以上Z-score矩阵，筛选出至Z-score>0 的转录因子作为对应细胞类群/类型潜在的调控因子，此RelativeActivity值即为Z-score值。按亚群/celltype计算AUC值（top_Regulon_CellType_activity）结果表如下所示：

表注：Regulon：调控子，具体是指受同一个调控元件（转录因子）调控的一群基因的集合。每个调控子可以定义为一个转录因子及其靶基因的集合；celltype：细胞类型。有时候也指代cluster；RelativeActivity：调控子的活性得分值。

对top_Regulon_CellType_activity.csv进行可视化，结果见下：按亚群/celltype计算AUC值热图

图注：行为Regulon，列为cluster/Celltype，颜色为RelativeActivity即调控子的活性得分值。

由于不同Regulons包含的基因不同，它们之间的AUC值不具有可比较性，因此基于AUC值在所有细胞中的双峰分布特征，增加了Regulons“on/off”的概念，认为双峰之间的低谷为判断Regulons活性开放的阈值，如果AUC值小于阈值，则判定为该Regulons在该细胞中未开放，即未发挥调控作用。最终获得每个Regulons在每个细胞中二进制的Regulon活性矩阵。

同样经过计算每个亚群中细胞的平均活化值，再对每个转录因子的亚群平均活化值进行zscore归一化，筛选Z-score>0 的转录因子作为对应细胞类群/类型潜在的调控因子，此RelativeActivity值即为Z-score值。按亚群/celltype计算AUC值（top_Regulon_CellType_binary_activity）的二分法结果表:

表注：Regulon：调控子，具体是指受同一个调控元件（转录因子）调控的一群基因的集合。每个调控子可以定义为一个转录因子及其靶基因的集合；celltype：细胞类型。有时候也指代cluster；RelativeActivity：调控子的活性得分值。

对top_Regulon_CellType_activity.csv进行可视化，结果见下：按亚群/celltype计算AUC值二分法热图（Regulon_activity_cluster_binary_heatmap）

图注：行为Regulon，列为cluster/Celltype，颜色为RelativeActivity即调控子的活性得分值。

将Regulon的AUC值、二进制的活性值表达量、和相关TF的表达量映射到t-SNE/UMAP坐标中，结果见下：

注意：该模块图片默认展示Regulon活性热图。此图上方可以切换可视化方式。如需下载图片，点击下载按钮即可！表格默认展示转录因子基因调控结果表。此表上方可以切换可视化方式，其他表格请在文件管理处下载！  

3.3 Regulon特异性评分（RSS）结果

对某类细胞的调控子特异性评分（RSS）排序，可以发现最特异的调节因子。即当细胞类型过多时，可以用RSS（Regulon Specificity Score）来识别细胞类型特异性regulon。Regulon特异性评分（RSS）结果表（Regulon_RSS_CellType.csv）

表注：Regulon：调控子，具体是指受同一个调控元件（转录因子）调控的一群基因的集合。每个调控子可以定义为一个转录因子及其靶基因的集合；其余列代表的是cluster或者celltype。

对Regulon_RSS_CellType.csv进行可视化，结果见下：Regulon特异性评分气泡图

图注：行为Regulon，列为cluster/Celltype，颜色为Z-score值，圆圈大小为RSS，越大说明Regulon特异性越高。

对Regulon_RSS_CellType.csv进行可视化，结果见下：Regulon特异性评分热图

图注：行为Regulon，列为cluster/Celltype，颜色为RSS，越红说明Regulon特异性越高。

每个celltype Regulon活性得分详情图结果见下：

图注：此图指代的是某一细胞类型中Regulon的特异性排序图。横坐标表示排名，纵坐标表示RSS特异性得分。排名前三位的Regulon以红色点表示。RSS越高的调控子可能与该细胞类型特异性相关。

注意：该模块图片默认展示Regulon特异性评分气泡图。此图上方可以切换可视化方式。如需下载图片，点击下载按钮即可！

3.4 Regulon关联特异性指数(CSI)结果

通过RAS来计算不同regulon之间的相关性系数（PCC, Pearson Correlation Coefficient），基于PCC，计算了CSI（Connection Specificity Index）来衡量regulon pairs之间的相关性，之后基于CSI对regulon进行层次聚类，其结果见下：Regulon关联特异性指数(CSI)聚类图

图注：行列均为Regulon，颜色由浅到深表示CSI值由低到高。CSI值较高的Regulon之间可能具有相似的细胞功能，共同调控下游基因。