时序分析-STEM

1.工具概述：

时序分析（时间序列表达分析）是对处于不同时间点的同一（或同类）样本进行基因表达测量，以观测各个时间点上基因表达的变化情况，并阐释基因间相互依赖关系的变化规律，通过趋势分析可以找到具有相同表达模式的基因。（注：仅适合于按照时间顺序取样的实验方案，比如对植物做某种胁迫处理，依此处理0 h，2 h，4 h，8 h等不同时间后分别进行取样，且至少取3三个时间节点。）

应用场景：寻找及可视化基因在连续变化的样本或组中丰度的变化趋势，推荐用于3-8组研究。

2.分析软件：

STEM（Version 1.3.11）由java语言编写而成，简捷且方便操作，主要是用于对短时间序列的基因表达数据（少于或等于8个时间点）进行聚类、比较和可视化。基于STEM进行时序表达趋势分析，可以探讨该样品在这个时间段内的多个时间点的基因表达模式，继而对某个表达模式的基因进行功能类富集，从而挖掘其生物学功能；同时可以预测基因间调控网络在时序上的变化趋势，挖掘不同时间基因调控网络中与时间或其他特定因素相关的模块。其包括两种聚类算法：

1）STEM聚类算法：属于一种有监督的算法，即聚类归入人为设定的趋势里。其基本过程为软件先按照预设模拟出n种最具有代表性的可能趋势（一种趋势就是一种基因表达模式），然后计算出每一个基因与预设的这些趋势的相关系数，最后将每一个基因归类到与其最为相似的趋势中。

2）K-means算法：硬聚类算法，是典型的基于原型的目标函数聚类方法的代表，它是数据点到原型的某种距离作为优化的目标函数，利用函数求极值的方法得到迭代运算的调整规则。属于无监督算法，结果不可控。

3.操作方法：

①任务名称：对本次小工具运行任务进行命名，方便后续任务查找及分析结果查看。

②表达量矩阵表：第一列为基因id，后面为基因在不同样品的表达量，趋势顺序按样品在表格中的顺序排列。输入的表格文件，必须为txt格式，可以选择在excel中将数据打开，然后另存为"文本文件（制表符分隔）（*.txt）"。

示例文件：gene_express.txt

③数据预处理方式：预处理有3种参数，分别是：

a）log2标准化；

这个我们推荐的设置。就是以第一个时间点为对照，计算所有样本相对第一个时间点的表达量倍数。并对表达量倍数取log2值（log2处理的倍数值）。这样处理后，第一个样本的表达量为0，后续大于0的样本就是表达上调的样本，小于0的样本就是表达下调的样本。

b）标准化；

就是以第一个时间点为对照，计算所有样本相对第一个时间点的表达量的差值（直接使用差值）。这样处理后，第一个时间点的样本表达量依然为0，但后续的时间点样本的数值会波动很大。因为同样是表达差异倍数为2倍的基因，从10上调到20，其差值是10。而从1000上调到2000就是差值1000。而通常趋势分析更关注倍数的变化，更不是绝对值的差异。所以这个参数不推荐。

c）不做标准化/加0

直接使用输入软件的原始值进行趋势分析。因为在某些情况下，你希望直接观察表达量绝对值的变化，而不希望使用变化倍数或差值。或者，你输入软件的是两组平行实验的log2 差异倍数值（A1vsB1,A2vsB2,A3vsB3），这种数据也不应该按照以上第一种和第二种策略预处理。因为趋势分析软件默认第一个时间点的表达量为0（在前两个模式中都是如此）。所以为了保证原有的软件模块可以正常运行，STEM软件在这种模式下，会在第一个样本前加一个表达量为0的虚拟样本（但其实不存在）。

④目标基因列表：该参数为选填项，如果不上传该文件，则按照表达量矩阵表的所有基因进行分析。该文件内容为一列Gene_id，无表头信息，文件为txt格式。

示例文件：gene_list.txt

⑤时序样本信息表：“时序样本信息表”文件必须为txt格式，可以选择在excel中将数据打开，然后另存为"文本文件（制表符分隔）（*.txt）"。文件包括样本名，组别名以及样本时序节点的顺序。第一列为Sample（样本名，注：样本名必须与本项目的样本名一致。若样本名已变更，必须上传变更前的样本名），第二列为Group（组名，即样本所有同一组则标记相同的组名），第三列为order（时序节点的顺序）。

示例文件：sample_infor.txt

⑥时序聚类算法：STEM支持两种聚类方法：STEM和K-means，默认采用STEM聚类算法，具体算法原理可参见“分析软件”部分。

⑦时序模式数目：就是预先设定的趋势的数量。建议设定为50个。因为趋势预设过多后，会导致趋势过于零碎而后期难以整理。软件本身会挑选最有代表性趋势（本身是这个软件的核心算法）作为预设趋势，所以你不用担心由于预设的趋势数量不够多，导致某些表达模式的基因无法被涵盖。每个基因将会被分配给与其最相似的趋势，但也要求这个基因的表达模式和该趋势的相关系数>0.7（默认值）。

⑧时序间隔最大值：两点间时序间隔的最大值,根据设置的最大间隔值,即能推断出后续可能出现的时间点变化的所有排列组合，默认1，建议1-5内的正整数。

⑨显著趋势P值：趋势分析就是将各个基因分配到预设的有代表性的趋势中。如果某类基因与我们的实验处理相关，那它们的表达模式理论上是相似的，会集中在特定的趋势中。那么就会导致这个趋势的基因的数量大于随机分布的期望值。这个原理和GO、KEGG富集分析的原理相似。软件在完成富集分析后，会按照你设定的显著性阈值（例如：Padjust=5%，使用Bonferroni校正）判定显著富集的趋势。显著富集的趋势在最终输出的趋势总图中，将会有颜色标注。而不显著的趋势，则没有颜色。

但注意：有颜色的显著富集的趋势值得我们优先关注，但并不意味着不显著的趋势就没有生物学意义，不值得关注。因为统计显著性本身受很多因素的影响，这里的富集检验只是给大家一个数据挖掘的优先级。

4.结果解读：

①Profile n：模块编号；

②趋势线：趋势线为每个模块内基因拟合的曲线，每一组为一个拐点；

③模块左下角数值：P值，代表富集的显著性；

④模块颜色：有颜色模块为p<0.05的模块的显著富集的模块。趋势类似，模块颜色相同，进行分析时可将模块内基因归为一类进行分析，如下图中的profile4和7，都为上升的趋势。

5.参考文献：

[1] J. Ernst, Z.Bar-Joseph. STEM: a tool for the analysis ofshort time series gene expression data. BMC Bioinformatics, 7:191, 2006.